62/2000 영유아 건강 보호! 완이 이온 크로마토그래피, 7가지 인체 밀

서문

인간 모유 올리고당(HMO)은 중합도가 3 이하인 올리고당 그룹으로, 모유에 자연적으로 존재합니다. 락토스와 지방 다음으로 모유의 세 번째로 큰 고형 성분입니다. 유아의 장내 유익균, 특히 비피도박테리움의 군집화를 촉진하여 장내 유익균을 조절하고, 장 건강을 유지하며, 면역 및 뇌 발달을 지원하고, 항감염 효과를 발휘하여 유아 성장에 중요한 역할을 합니다. 2015년 미국에서 최초의 HMO 강화 분유가 출시된 이후, 전 세계적으로 HMO를 함유한 다양한 분유, 우유 및 유제품, 소화 건강 보조제 및 기능성 식품이 판매되었습니다. 2023년 6월 1일 기준으로 미국과 EU는 2'-푸코실락토스, 3'-푸코실락토스, 디푸코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-테트라오스, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 등 7가지 HMO의 사용을 승인했습니다.

일반적인 HMO 검출 방법 중 액체 크로마토그래피는 검출 전에 유도체화 반응이 필요하고, 복잡한 시료 전처리가 필요하며, 유도체화 시약은 종종 독성이 있습니다. 또한 HMO의 열에 불안정한 특성은 LC-MS에서 낮은 응답과 낮은 반복성을 초래합니다. 반면에 탄수화물에 대한 전기화학 검출을 이용한 이온 크로마토그래피는 간단한 시료 전처리, 높은 응답 및 좋은 반복성을 제공하여 HMO 분석에 명확한 이점을 제공합니다. 이 응용 노트는 수동으로 준비된 수산화나트륨, 아세트산나트륨 및 초순수를 이동상으로 사용하고, WAYEAL IC6300 이온 크로마토그래프를 사용하여 분유에서 HMO를 결정합니다. 이 방법은 간단한 시료 전처리, 높은 감도 및 좋은 직선성을 특징으로 하며, 식품에서 HMO 검출에 유용한 참고 자료를 제공합니다.

키워드: 이온 크로마토그래프; 인간 모유 올리고당; 전기화학 검출기.

1. 기기, 장비 및 시약

1.1 시약 및 표준

표 1. 시약 및 표준 목록

1.2 실험실 재료 및 보조 장비

• 1.2.1 분석 저울(0.1 mg 판독값);
• 1.2.2 항온 수조;
• 1.2.3 원심분리기;
• 1.2.4 수성 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터(0.45 µm);
• 1.2.5 초순수;
• 1.2.6 진공 여과 장치;
• 1.2.7 RP 고체상 추출(SPE) 전처리 카트리지;
• 1.2.8 일회용 주사기(20mL, 5mL).

2. 실험 방법

2.1 용액 준비

• 2.1.1 200 mmol/L 수산화나트륨 용액: 50% NaOH 10.5mL를 피펫으로 옮겨 물로 1000mL까지 희석하고 진공 여과합니다.
• 2.1.2 75 mmol/L NaOH 및 250 mmol/L 아세트산나트륨 혼합 용액: 아세트산나트륨 20.51g을 정확히 칭량하여 물에 녹이고 1000mL 부피 플라스크로 옮깁니다. 50% NaOH 3.95mL를 정확히 피펫으로 옮겨 초순수로 1000mL까지 희석하고 진공 여과합니다.
• 2.1.3 3% 설포살리실산 용액: 설포살리실산 3.0g을 칭량하여 물에 녹이고 100mL까지 희석합니다(신선하게 준비).
• 2.1.4 혼합 표준 원액: 2'-푸코실락토스, 3'-푸코실락토스, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 락토-N-테트라오스 및 락토-N-네오테트라오스 각각 5mg(0.1mg 단위까지)을 정확히 칭량하여 10mL 부피 플라스크에 넣고 물에 녹여 표선까지 희석하여 500mg/L 혼합 원액을 준비합니다. 디푸코실락토스 1mg(0.1mg 단위까지)을 별도로 칭량하여 10mL 부피 플라스크에 넣고 녹여 표선까지 희석하여 100mg/L 원액을 준비합니다.
• 2.1.5 혼합 표준 작업 용액: 혼합 원액(2.1.4)을 부피 플라스크에 정확히 피펫으로 옮겨 물로 희석하여 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT 및 DFL을 0.5, 2, 4, 6, 8, 10mg/L로 하는 혼합 작업 용액을 준비합니다. 사용 전에 신선하게 준비합니다.

2.2 시료 전처리

약 2.0g의 시료를 작은 비커에 칭량하고, 50mL의 따뜻한 물(약 50°C)과 잘 섞은 후, 3% 설포살리실산 용액 40mL를 첨가합니다. 부피 플라스크로 옮겨 100mL까지 희석하고 10분간 초음파 처리합니다. 여과지 또는 원심분리기(12,000 rpm, 15분)로 여과합니다. 시료 용액을 RP SPE 카트리지를 통과시킨 후 0.45 µm 수성 멤브레인 필터를 통과시킵니다. 처음 3mL는 버리고 용출액을 분석용으로 수집합니다. 사용 전에 RP SPE 카트리지를 메탄올 20mL로 컨디셔닝한 후 물 15mL로 컨디셔닝하고 30분간 평형시킵니다.

2.3 실험 조건

2.3.1 이온 크로마토그래피 조건

3. 결과

3.1 선형 범위

각 혼합 표준 작업 용액의 적절한 양을 분석했습니다. 선형 범위는 0.5-10mg/L였으며, 측정 농도와 명목 농도 간의 편차는 최대 허용 편차 이내였고, R² 값은 0.999 이상이었으며, 모든 성분은 좋은 직선성을 보였습니다.

표 2. 화합물의 선형 범위

그림 1. 7가지 HMO 표준 물질의 보정 크로마토그램 중첩

3.2 시료 시험 결과

시료 1과 2는 10배 희석 후 시험했습니다. 7가지 HMO 각각의 함량은 다음과 같이 계산했습니다: X는 시료 중 함량(mg/100g); c는 보정 곡선에서 얻은 시료 용액의 농도(mg/L); V는 일정 부피(mL); m은 시료 질량(g); f는 희석 계수입니다. 계산된 함량(mg/100g)은 다음과 같습니다:

그림 2. 시료 1의 10배 희석된 이온 크로마토그램

그림 3. 시료 2의 10배 희석된 이온 크로마토그램

표 3. 시료 시험 결과

3.3 정밀도

2.3.1의 조건 하에서 4번째 보정 수준의 작업 용액을 6회 연속 주입하여 분석했습니다. 반복성을 평가하기 위해 7가지 HMO 함량의 RSD를 계산했습니다. 아래 결과는 좋은 방법 정밀도를 나타냅니다.

3.3.1 표준 반복 정밀도

시험 결과:

그림 4. 보정 표준 S4의 독립적인 반복 주입 크로마토그램 중첩

표 4. 표준의 반복 정밀도

3.4 검출 및 정량 한계

LOD: 표준 용액의 일부를 3'-FL 10 µg/L, DFL 30 µg/L, 2'-FL 30 µg/L, LNnT 22 µg/L, LNT 67 µg/L, 6'-SL 67 µg/L, 3'-SL 160 µg/L를 함유하는 혼합 용액으로 희석했습니다. 20개의 병렬 시료를 준비하여 분석했습니다.

LOQ: 표준 용액의 일부를 3'-FL 30 µg/L, DFL 80 µg/L, 2'-FL 90 µg/L, LNnT 65 µg/L, LNT 200 µg/L, 6'-SL 200 µg/L, 3'-SL 500 µg/L를 함유하는 혼합 용액으로 희석했습니다. 6개의 병렬 시료를 준비하여 분석했습니다.

시험 결과는 다음과 같습니다:

표 5. 7가지 HMO의 LOD 및 LOQ에 대한 S/N 결과

3.5 특이성

포도당, 과당, 설탕 및 맥아당 표준 용액 각각 100 µL를 10mL 부피 플라스크에 넣고 시료 2 용액 67배 희석액으로 표선까지 희석했습니다. 이 용액을 분석하여 이 당들이 7가지 HMO 피크를 방해하는지 확인했습니다. 아래 그림에서 보듯이, 4가지 당은 분유에서 7가지 HMO 결정에 유의미한 방해를 보이지 않았습니다.

그림 5. 보정 S6, 시료 2, 및 4가지 당 표준 물질을 첨가한 시료 2의 크로마토그램 중첩

4. 결론

이 검증에서는 WAYEAL 이온 크로마토그래프를 사용하여 식품에서 HMO를 결정하는 방법을 검증했습니다. 데이터에 따르면 모든 크로마토그래피 피크는 테일링 없이 잘 형성되었으며, 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL 및 3'-SL은 모두 60분 이내에 용출되었습니다. 감도는 국가 표준 요구 사항을 충족하며, 선형 상관 계수는 모두 0.999 이상입니다. 표준 및 시료의 반복성은 모두 좋습니다. 두 가지 시알릴락토스를 제외하고 LOD 및 LOQ는 µg/L 수준입니다. 이 방법은 특이성이 좋고, 방해하는 불순물이 발견되지 않았으며, 전반적으로 표준 요구 사항을 충족합니다.