Wayeal LCMS-TQ9200 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템을 이용한 항생제 발효 잔류물 내 에리스로마이신 잔류물 측정

에리스로마이신(Erythromycin)은 스트렙토마이세스 에리쓰레우스(Streptomyces erythreus)의 발효에 의해 생산되는 마크로라이드 항생제입니다. 주로 세균의 단백질 합성을 억제함으로써 항균 효과를 발휘합니다. 에리스로마이신 생산은 주로 균주 선택, 종자 배양, 탱크 내 대규모 발효, 추출 및 정제와 같은 단계를 포함하는 생물 발효 기술에 의존합니다. 발효 후 에리스로마이신은 유기용매(예: 부틸 아세테이트)로 추출된 후 결정화 또는 이온 교환 수지 분리를 통해 정제되어 최종적으로 임상 등급의 염(예: 에리스로마이신 에틸숙시네이트)이 생성됩니다. 그러나 에리스로마이신 생산 과정에서는 상당한 양의 균사 찌꺼기(발효 잔류물)가 생성되며, 여기에는 잔류 항생제, 미생물 단백질 및 대사 부산물이 포함될 수 있습니다. 적절하게 관리하지 않으면 이러한 잔류물이 환경 배출이나 사료 첨가제로 사용되어 생태계에 유입되어 여러 가지 위험을 초래할 수 있습니다. 잔류 에리스로마이신은 토양과 수역에서 항생제 저항성 유전자의 확산을 촉진하여 미생물 군집 균형을 방해할 수 있습니다. 먹이사슬을 통해 증폭되면 동물이나 인간에게 저항성 박테리아 종의 출현을 유도하여 항생제 효능을 약화시킬 수 있습니다. 더욱이, 잔여물 내의 활용도가 낮은 유기물은 환경 오염을 일으킬 수 있습니다. 그러므로 균사체 잔류물의 엄격한 규제는 에리스로마이신 생산으로 인한 오염을 통제하기 위한 중요한 조치입니다.

이 실험은 표준 "중국 제약 산업 협회의 T/PIAC 00003 - 2021 그룹 표준 - 항생제 잔류물, 유기 비료 기본 물질, 작물 및 환경 매체에서 에리스로마이신 측정 방법"을 참조하여 Wayeal LCMS-TQ9200 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템을 활용하여 균사 찌꺼기 중 에리스로마이신 함량을 측정하여 수행되었습니다. 실험 결과는 시스템 적합성 테스트에서 좋은 피크 모양과 좋은 선형성을 보여 실험 요구 사항을 충족했음을 나타냅니다.

1. 기기 및 시약

1.1 LCMS 구성 목록

표 1 기기 구성 목록

1.2 시약 및 표준

표 2 시약 및 표준 목록

1.3 실험재료 및 보조장비

초음파세척기

볼텍스 믹서

고속 원심분리기

2. 실험방법

2.1 시료 전처리

샘플 0.5g(정확도는 0.001g)을 달아 유리 마개가 있는 시험관에 넣습니다. 아세토니트릴 50mL를 넣고 1분간 vortex하여 균질화시킨 후 20분간 초음파 추출을 한다. 그런 다음 혼합물을 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 4000rpm에서 10분간 원심분리합니다. 상등액을 적당량 취하여 0.22μm 필터막에 통과시킵니다. 초기 여과액 최소 1mL를 버리고 남은 여과액을 황색 LC 바이알에 옮겨 분석합니다.

2.2 실험조건

2.2.1 액체 크로마토그래피 방법 조건

크로마토그래피 컬럼: C18 1.7μm 2.1x50mm

이동상: A: 아세토니트릴, B: 물에 0.1% 포름산

유속: 0.3mL/분

컬럼 온도: 30℃

주입량: 2μL

2.2.2 질량분석기 방법 조건

표 3 질량 분석법 이온 소스 매개변수

3. 실험결과

3.1 시스템 적합성 테스트

시스템 적합성 테스트 결과는 외부 피크의 간섭 없이 잘 정의된 목표 피크를 보여 모든 실험 요구 사항을 충족했습니다.

그림 1 에리스로마이신 A 표준 작업 용액(0.5ng/mL)의 크로마토그램

3.2 선형 범위

에리스로마이신 A의 검량선은 표준용액을 중간농도의 작업용액을 이용하여 연속적으로 희석하여 작성하였다. 이 곡선은 0.5-500ng/mL 범위에서 우수한 선형성을 보여 주었으며 상관 계수(R²)는 0.99보다 컸습니다.

표 4 에리스로마이신 A의 선형 범위

그림 2 에리스로마이신 A에 대한 검량선

3.3 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ)

본 방법에서 에리스로마이신 A 표준액의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.2ng/mL, 0.5ng/mL로 측정되었다. 해당 신호 대 잡음비(S/N)는 110.02와 292.20으로 최소 요구 사항인 3과 10을 크게 초과하여 실험적 감도 기준을 충족했습니다.

그림 3. 에리스로마이신 A의 LOD 및 LOQ에 대한 추출된 이온 크로마토그램

3.4 정밀도 테스트

에리스로마이신 A 용액을 7회 연속 주입한 결과는 아래 그림과 같습니다. 에리스로마이신 A의 머무름 시간 편차는 0.19%, 피크 면적 편차는 0.96%로 둘 다 5% 미만으로 실험 요구 사항을 충족했습니다.

그림 4. 에리스로마이신 A 시료(7회 주입)의 정밀 크로마토그램

3.5 샘플 테스트

앞서 언급한 전처리 방법에 따라 고체 시료의 목표 피크 면적은 7.4E6이었습니다. 외부표준품법으로 계산한 결과, 검액 내 에리스로마이신 A 함량은 400ng/mL로 측정되었습니다.

그림 5 에리스로마이신 A 샘플 테스트의 크로마토그램

4. 결론

이 방법은 항생제 발효 잔류물에서 에리스로마이신 A 함량을 측정하기 위해 Wayeal LCMS-TQ9200 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템을 활용합니다. 데이터는 이 분석법이 탁월한 성능을 입증했음을 나타냅니다. 모든 크로마토그래피 피크는 테일링 없이 최적의 모양을 나타내며 감도는 실험 요구 사항을 충족합니다. 선형 상관 계수(R²)가 0.99를 초과합니다. 7회 연속 주입에서 모든 화합물의 머무름 시간과 피크 면적 편차가 1% 이내로 높은 정밀도를 나타냅니다. 샘플 크로마토그램에서는 외부 피크로 인한 간섭이 나타나지 않으며 측정된 샘플 함량은 400ng/mL입니다. Wayeal LC-MS/MS 시스템을 갖춘 이 방법은 테스트 샘플의 일상적인 정성 및 정량 분석에 대한 요구 사항을 충족합니다.